高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography 簡稱 HPLC）是一種用途廣泛、分析能力極強(qiáng)的色譜技術(shù)，在藥物生產(chǎn)和研究的許多方面都有應(yīng)用。它根據(jù)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和成分，將混合物分離或識別為不同的成分。
引言
HPLC 應(yīng)用最廣泛的分離技術(shù)。它非常靈敏、特異和精確。
- 它是柱層析的一種特殊形式，用于生物化學(xué)和分析，以分離、鑒定和量化混合物中的活性化合物。
- 在 HPLC 上有填料（固定相），泵使流動(dòng)相通過色譜柱，檢測器顯示分析物的保留時(shí)間。
- 保留時(shí)間是可變的，主要取決于固定相、分析物和所用溶劑之間的相互作用。
- 少量待分析樣品被引入流動(dòng)相流，并通過與固定相的特定化學(xué)或物理相互作用而被保留
- 保留取決于分析物的性質(zhì)以及固定相和流動(dòng)相的成分。
- 高效液相色譜法（HPLC）最常用的溶劑是甲醇和乙腈。
原理
高效液相色譜法（HPLC）是將少量液體樣品注入裝有微小顆粒（直徑為 3 至 5 um，稱為固定相）的管子中，樣品中的單個(gè)成分隨著通過泵輸送的高壓液體（流動(dòng)相）通過色譜柱進(jìn)入裝有顆粒的管子。
柱填料用于將成分相互分離。這涉及到其分子與填料顆粒之間的各種化學(xué)和/或物理相互作用。
分離出來的成分會(huì)在色譜柱出口處被檢測器檢測到，檢測器會(huì)測量這些成分的含量。檢測器的輸出稱為 "液相色譜圖"。
圖 1. 描述了高效液相色譜法的基本原理。步驟 1.引入樣品（流動(dòng)相）。步驟 2.將樣品分離成各種成分（固定相）。步驟 3.將樣品分離成各組分（流動(dòng)相）。
與低壓柱液相色譜法相比的優(yōu)勢
與傳統(tǒng)的低壓柱液相色譜法相比，高效液相色譜法（HPLC）有許多優(yōu)勢。
- 靈敏度更高（可使用各種檢測器）
- 更高的分辨率
- 速度更快
- 便于樣品回收（移除的流動(dòng)相更少）
- 多種固定相可適用
分支
色譜法分為氣相、液相和超臨界流體技術(shù)。氣相色譜法又分為氣-液技術(shù)和氣-固技術(shù)。
液相色譜法分為薄層色譜法等相對較多的技術(shù)。加壓液相色譜法又可分為離子交換色譜法、排阻色譜法、分配色譜法和液固色譜法。
液相色譜法分為薄層色譜法等相對較多的技術(shù)。加壓液相色譜法又可分為離子交換色譜法、排阻色譜法、分配色譜法和液固色譜法。
圖 2.描述色譜法的分支。
類型
HPLC 的以下變體取決于工藝中的相系統(tǒng)（固定相）。
1. 正相高效液相色譜法
又稱正相色譜法或吸收色譜法。這種方法根據(jù)極性分離分析物。它有一個(gè)極性固定相和非極性流動(dòng)相。因此，固定相通常為二氧化硅，典型的流動(dòng)相為正己烷、二氯甲烷、氯仿、二乙醚和混合物。該技術(shù)適用于對水敏感的化合物、幾何異構(gòu)體、順反異構(gòu)體、類別分離和手性化合物。
2. 反相高效液相色譜法
固定相為非極性（疏水性），流動(dòng)相為水性、中等極性。它的工作原理是疏水相互作用，因此材料的非極性越強(qiáng)，保留時(shí)間就越長。這種技術(shù)適用于非極性、極性、可電離和離子分子。
3. 體積排阻高效液相色譜法
又稱凝膠滲透色譜法或凝膠過濾色譜法。色譜柱中填充有精確控制孔徑的材料，顆粒根據(jù)分子大小被分離。較大的分子迅速通過色譜柱；較小的分子則穿過多孔填料顆粒，隨后洗脫出來。體積法還有助于確定蛋白質(zhì)和氨基酸的三級和四級結(jié)構(gòu)。它還可用于測定多糖的分子量。
4. 離子交換高效液相色譜
在這種色譜法中，保留是基于溶質(zhì)離子與固定相上的帶電位點(diǎn)之間的吸引力。帶相同電荷的離子會(huì)被排除在外。這種技術(shù)可用于純化水、蛋白質(zhì)的配體和離子交換色譜、碳水化合物和低聚糖的高 pH 陰離子交換色譜等。
5. 生物親和高效液相色譜
在這類色譜中，分離是基于蛋白質(zhì)與配體的可逆相互作用。
組成
圖片系統(tǒng)的核心是進(jìn)行分離的色譜柱。
1. 溶劑儲(chǔ)液器：玻璃儲(chǔ)液器中含有流動(dòng)相內(nèi)容物。高效液相色譜法中的流動(dòng)相或溶劑通常是極性和非極性液體成分的混合物，其各自的濃度根據(jù)樣品的成分而變化。
2. 泵：泵將流動(dòng)相從溶劑儲(chǔ)液器中吸出，并迫使其通過系統(tǒng)的色譜柱和檢測器。根據(jù)色譜柱的尺寸、固定相的粒度、流速和流動(dòng)相的成分等因素，工作壓力最高可達(dá) 42000 kPa（約 6000 psi）。
3. 樣品進(jìn)樣器：進(jìn)樣器可以是單次進(jìn)樣，也可以是自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)。用于高效液相色譜系統(tǒng)的進(jìn)樣器應(yīng)能在高壓（高達(dá) 4000 psi）條件下對體積在 0.1-100 mL 范圍內(nèi)的液體樣品進(jìn)行進(jìn)樣，并具有較高的重現(xiàn)性。
4. 色譜柱：色譜柱通常由拋光不銹鋼制成，長度在 50 至 300 毫米之間，內(nèi)徑在 2 至 5 毫米之間。色譜柱通常填充粒徑為 3-10 微米的固定相。內(nèi)徑小于 2 毫米的色譜柱通常稱為微孔色譜柱。理想情況下，流動(dòng)相和色譜柱的溫度在分析過程中應(yīng)保持恒定。
5. 檢測器：高效液相色譜檢測器位于色譜柱的末端，在分析物從色譜柱洗脫出來時(shí)對其進(jìn)行檢測。常用的檢測器有紫外光譜檢測器、熒光檢測器、質(zhì)譜檢測器和電化學(xué)檢測器。
6. 數(shù)據(jù)收集裝置：檢測器發(fā)出的信號可收集到圖表記錄器或電子積分器上，它們的復(fù)雜程度和處理、存儲(chǔ)和再處理色譜數(shù)據(jù)的能力各不相同。計(jì)算機(jī)將檢測器對每種成分的響應(yīng)進(jìn)行整合，并將其放入色譜儀中，以便于讀取和解釋。
應(yīng)用
高效液相色譜法可獲得的信息包括化合物的分辨、鑒定和定量。它還有助于化學(xué)分離和純化。高效液相色譜的其他應(yīng)用包括
- 制藥應(yīng)用：控制藥物穩(wěn)定性。藥物劑型的片劑溶出度研究。藥品質(zhì)量控制
- 環(huán)境應(yīng)用：檢測飲用水中的酚類化合物。污染物的生物監(jiān)測。
- 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用：生物樣本中的藥物定量。鑒定血液、尿液等中的類固醇。紡織品染料的法醫(yī)分析。測定血液、尿液等中的可卡因和其他濫用藥物。
- 食品和香料：軟飲料和水的質(zhì)量測定。果汁中的糖分分析 蔬菜中多環(huán)化合物的分析。防腐劑分析。
- 在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用：尿液分析、血液中的抗生素分析。肝臟疾病中膽紅素和膽綠素的分析。檢測腦細(xì)胞外液中的內(nèi)源性神經(jīng)肽等。
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